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溶菌酶的分離純化
  • 發布日期:2018-01-03      瀏覽次數:3151
    • 1. 蛋清樣品的準備 

      市售新鮮雞蛋5個,破蛋殼取出蛋清,加入1.5倍體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH 7.0,攪拌均勻,并調pH 7.0,然后用八層紗布過濾,留取上清液,量取體積并記錄,留0.4mL上清液,并加入0.4mL甘油-20℃凍存備用。 

       

      2.陽離子交換層析 

      (1)陽離子交換樹脂的再生:20g Amberlite-CG-50陽離子交換樹脂用0.5mol/L NaOH浸泡30min,水洗至中性,再用0.5mol/L HCl浸泡30min,水洗至中性。 

      (2)平衡:在燒杯中將再生好的陽離子交換樹脂中用0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0平衡。 

      (3)吸附:在已平衡好的陽離子交換樹脂中加入蛋清樣品,攪拌吸附1h(不能用磁力攪拌器)。 

      (4)洗滌:倒去其余上清液,樹脂用100mL0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0洗滌3遍。 

      (5)裝柱:將樹脂攪拌均勻裝入2.6cm×30cm層析柱,再用300mL含0.05 mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0洗滌雜蛋白。(裝柱前,先檢測層析柱是否潔凈,保證所有接頭密閉、管道暢通;裝柱時,流速不得超過3mL/min,全過程不能出現“流干”現象) 

      (6)洗脫:用300mL含0.5 mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0以3mL/min流速進行洗脫,合并光吸收高峰管,量取體積并記錄,留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油-20℃凍存備用。 

       

      3. 硫酸銨沉淀 

      每100mL上清液中緩慢加入35g固體硫酸銨,溶解后凈置30min,10 000r/min離心10min,沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0溶解,留0.05mL上清液,并加入0.05mL甘油,-20℃凍存備用。 

       

      4. 分子篩層析

      將溶解后的硫酸銨沉淀樣品10 000r/min離心3min、上光已用pH 7.0  0.1mol/L NaCl的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液平衡好的Sephacyl S-100HR柱,洗脫,洗脫流速為15mL/h,分部收集洗脫峰,2mL/管。合并光吸收高峰管。 

       

      5. 透析濃縮 

      用含50%甘油的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0透析濃縮4h,-20℃分裝凍存備用。

    魏經理
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