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CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)在血液惡性腫瘤中顯示出令人印象深刻的療效。去年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了兩種靶向CD19的CAR-T細(xì)胞療法，諾華的tisagenlecleucel（Kymriah™）用于白血病（2017年8月）和淋巴瘤（2018年5月），以及Kite Pharma的axicabtagene ciloleucel（Yescarta™）用于淋巴瘤（2017年10月）。
這也推動(dòng)了在實(shí)體瘤中誘導(dǎo)相似功效的CAR的發(fā)展。然而，該過(guò)程在實(shí)現(xiàn)足夠的功效之前，還面臨著多個(gè)必須解決的挑戰(zhàn)：
在實(shí)體瘤中CAR-T細(xì)胞治療的眾多挑戰(zhàn)中，一個(gè)主要障礙是缺乏真正的腫瘤特異性靶抗原，這迫使細(xì)胞免疫學(xué)家靶向在腫瘤上過(guò)表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens, TAAs），但由于TAA也在正常組織和器官表達(dá)，具有安全風(fēng)險(xiǎn)。
此外，實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）特別是免疫抑制劑，阻止有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。免疫抑制性TME含有多種成分，包括物理屏障，如致密的細(xì)胞外基質(zhì)；功能失調(diào)的上皮細(xì)胞；代謝檢查點(diǎn)，如缺氧；免疫屏障，如免疫抑制細(xì)胞因子/分子和免疫抑制性免疫細(xì)胞。
近日，CAR-T領(lǐng)域“大牛”賓夕法尼亞大學(xué)的Carl June教授在Frontiers in Immunology上發(fā)表了綜述，針對(duì)目前CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的嚴(yán)峻形勢(shì)，指出：為了有效地靶向?qū)嶓w瘤，必須同時(shí)解決影響功效和毒性的多種因素，深入了解CAR-T細(xì)胞生物學(xué)和影響CAR-T細(xì)胞療法治療窗的多種因素。
Carl June教授（圖片來(lái)源：Philadelphia Magazine）
在這篇綜述中，Carl June等人總結(jié)了CAR抗原識(shí)別機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)，還討論了調(diào)整和擴(kuò)展治療窗，使CAR-T細(xì)胞有效且安全地靶向?qū)嶓w瘤的合理策略。
或許，能給正在實(shí)體瘤CAR-T細(xì)胞療法中掙扎的你一些有用的信息。
CAR-T細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)
雖然已經(jīng)深入研究了T細(xì)胞通過(guò)TCR與靶標(biāo)相互作用的基本機(jī)制，但CAR與靶標(biāo)相互作用的機(jī)制尚不清楚。CAR由TCR復(fù)合物和抗體的組合部分組成，因此討論CAR與內(nèi)源性、未修飾的TCR-T細(xì)胞的相似性，以及定義CAR的明顯差異能更好地理解CAR-T細(xì)胞生物學(xué)。
CAR-T和TCR-T細(xì)胞生物學(xué)因素的比較
TCR與CAR的結(jié)構(gòu)對(duì)比（圖片來(lái)源：Science）
>>>>TCR
由TCRα和TCRβ亞基組成的異二聚體。每個(gè)亞基含有可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（V）和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域（C），其后是跨膜區(qū)。每個(gè)V結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），其與主要組織相容性復(fù)合物（MHC）上呈遞的肽相互作用。
TCR本身不具有信號(hào)結(jié)構(gòu)域，需要由CD3復(fù)合物啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。CD3復(fù)合物由三個(gè)二聚體組成，分別是CD3ζε、CD3δε異二聚體和CD3ζζ同二聚體。
>>>>CAR
合成的嵌合蛋白，被引入T細(xì)胞以重定向抗原特異性并增強(qiáng)細(xì)胞功能。通常地，CAR由來(lái)自mAb的單鏈可變片段（scFv）、細(xì)胞外間隔區(qū)（稱(chēng)為鉸鏈）、跨膜結(jié)構(gòu)域、CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和通常一或兩個(gè)（第二代或第三代）共刺激結(jié)構(gòu)域組成。
非典型構(gòu)建的CAR利用受體配體或肽作為細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域，例如zetakine CAR：白細(xì)胞介素-13受體α2（IL13Rα2）zetakine CAR。
CAR賦予T細(xì)胞以不依賴(lài)于MHC的方式通過(guò)scFv（抗體識(shí)別）直接結(jié)合表面抗原的益處。CAR可以通過(guò)CD3ζ和共刺激結(jié)構(gòu)域同時(shí)向T細(xì)胞傳遞信號(hào)，這可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的化學(xué)計(jì)算的和潛在理想的活化。
CAR如何觸發(fā)免疫突觸形成和傳遞信號(hào)？
通過(guò)TCR和CAR形成免疫突觸
>>>>
TCR IS
T細(xì)胞活化是通過(guò)TCR與MHC-肽復(fù)合物（稱(chēng)為IS）的高度有組織的和動(dòng)態(tài)的相互作用介導(dǎo)的。成熟的IS是基于TCR信號(hào)的聚集體，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。
IS由三個(gè)同心的聚集分子環(huán)組成（圖A）：
IS的內(nèi)環(huán)被稱(chēng)為中心超分子激活簇（cSMAC），其中發(fā)生TCR信號(hào)傳導(dǎo)。cSMAC含有大多數(shù)TCR-MHC-肽復(fù)合物、CD28、PKC-θ和Lck；
外周SMAC（pSMAC）含有參與細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)，例如整聯(lián)蛋白LFA-1、細(xì)胞骨架連接子talin和ICAM1；
大分子，如CD43和CD45，被排除在pSMAC之外，構(gòu)成遠(yuǎn)端SMAC（dSMAC）；
裂解顆粒的分泌發(fā)生在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和靶細(xì)胞之間的IS變體（即分泌性突觸）內(nèi)。分泌性突觸在cSMAC中具有兩個(gè)獨(dú)立且不同的結(jié)構(gòu)域：（1）包含信號(hào)蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；（2）與細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶的胞吐作用有關(guān)的分泌結(jié)構(gòu)域。Stinchcombe等人證明，由Lck信號(hào)控制的瞬時(shí)極化和中心體對(duì)質(zhì)膜的對(duì)接，在指導(dǎo)這種分泌的機(jī)制中具有重要作用。
此外，抑制和共刺激分子，如PD-1、CTLA-4和ICOS也在IS區(qū)域聚集，并在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
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CAR IS
CAR下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和CAR形成IS的機(jī)制尚未得到廣泛研究。
已經(jīng)證明，在CD19特異性CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間，ZAP70向IS募集以及CD45被排除在IS之外，類(lèi)似于TCR活化。TCR的下游信號(hào)分子，如CD3ζ、LAT、Lck和ZAP70在CD19特異性CAR-T細(xì)胞被自體CD19+ B細(xì)胞激活后磷酸化。與第二代CAR-T細(xì)胞相比，第三代CAR-T細(xì)胞在TCR的下游信號(hào)分子上具有顯著更高的磷酸化狀態(tài)。
CAR IS（圖B）與TCR IS的結(jié)構(gòu)不同。CAR IS沒(méi)有呈現(xiàn)出系統(tǒng)性的靶眼結(jié)構(gòu)，而這是TCR IS的一個(gè)顯著特征。CAR IS肌動(dòng)蛋白（Actin）環(huán)的組織性很差，并且肌動(dòng)蛋白在CAR IS的中心可能不會(huì)*消失。LFA-1紊亂，CAR腫瘤抗原復(fù)合物在CAR IS的微團(tuán)簇形成隨機(jī)分布。
TCR IS需要5-10分鐘來(lái)形成靶眼結(jié)構(gòu)，而CAR IS可能不需要形成這些穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因?yàn)镃AR IS的無(wú)組織多焦點(diǎn)模式足以快速誘導(dǎo)顯著的近端信號(hào)傳導(dǎo)，其發(fā)生在短時(shí)間內(nèi)（<2分鐘）。
IS生物學(xué)的另一個(gè)重要部分是將細(xì)胞毒性顆粒（包括穿孔素和顆粒酶）遞送至由微管組織中心（MTOC）介導(dǎo)的IS。CAR的近端信號(hào)傳導(dǎo)的快速但短暫的持續(xù)時(shí)間也誘導(dǎo)MTOC快速遷移至IS并加速顆粒的遞送。
雖然CAR IS的機(jī)制已逐漸顯現(xiàn)，但尚不清楚CAR IS結(jié)構(gòu)的差異是否與CAR-T細(xì)胞的功效相關(guān)。
可溶形式CAR的配體，如CD30、間皮素和CEA，存在于單體形式不能觸發(fā)CAR信令，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)引起CAR二聚化。然而，CAR-T細(xì)胞可能潛在地識(shí)別可以以寡聚形式存在的可溶性配體，例如TGF-β，甚至無(wú)需細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。
CAR-T細(xì)胞識(shí)別的目標(biāo)密度閾值是多少？
為了解決CAR激活閾值的問(wèn)題，Watanabe等人研究了激活CD20特異性CAR-T細(xì)胞（CD28共刺激結(jié)構(gòu)域）所需的CD20密度，其中每個(gè)靶細(xì)胞表達(dá)約200-250,000個(gè)CD20分子。在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)低密度CD20（約200個(gè)分子/細(xì)胞）的靶細(xì)胞即可被CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)裂解。該數(shù)據(jù)與之前的報(bào)道一致，即CAR靶向小鼠OTS8的腫瘤特異性糖表位，其可以裂解具有相似低密度（~200分子/細(xì)胞）靶抗原的靶細(xì)胞。
Watanabe等人還證明誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生所需的靶抗原密度要高于誘導(dǎo)CAR介導(dǎo)的裂解所需的靶抗原密度。
總之，CAR-T細(xì)胞可識(shí)別具有相當(dāng)?shù)退降陌锌乖陌屑?xì)胞，并且它們具有針對(duì)細(xì)胞裂解、增殖和個(gè)體細(xì)胞因子產(chǎn)生的分級(jí)T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)閾值。CAR構(gòu)建體的差異（例如，scFv，鉸鏈，共刺激結(jié)構(gòu)域的親和力）或CAR表達(dá)密度，可以用于更地控制CAR-T細(xì)胞活化。
CAR-T細(xì)胞是否可以作為連環(huán)殺手？
內(nèi)源性T細(xì)胞和NK細(xì)胞可以連續(xù)裂解多個(gè)靶細(xì)胞（串聯(lián)殺傷），這很可能*腫瘤所必需的。然而，直到近，CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)連續(xù)殺傷的能力和靶細(xì)胞裂解的動(dòng)力學(xué)才得到充分證實(shí)。
Davenport等人使用一種新的轉(zhuǎn)基因小鼠模型測(cè)試了通過(guò)內(nèi)源性TCR或異位表達(dá)的CAR激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的功能。他們使用定時(shí)顯微錄影術(shù)（time-lapse video microscopy）清楚地證明CAR-T細(xì)胞是連續(xù)殺手。大約22％的CAR-T細(xì)胞依次向兩個(gè)或三個(gè)腫瘤細(xì)胞遞送致死命中，并且通過(guò)CAR連續(xù)殺死的頻率與通過(guò)TCR的頻率相當(dāng)。
腫瘤細(xì)胞裂解的動(dòng)力學(xué)分析表明，在前20小時(shí)內(nèi)，TCR和CAR介導(dǎo)等效的裂解動(dòng)力學(xué)。但與20小時(shí)后TCR介導(dǎo)的裂解相比，CAR介導(dǎo)的細(xì)胞裂解動(dòng)力學(xué)減慢。這種差異可以通過(guò)在抗原識(shí)別刺激后的CAR下調(diào)來(lái)解釋?zhuān)@可以通過(guò)基于TCR的CAR表達(dá)來(lái)改善。
CAR親和力如何影響T細(xì)胞功能？
T細(xì)胞活化受TCR和MHC-肽復(fù)合物之間相互作用的調(diào)節(jié)，并且影響活化敏感性的主要因素是靶抗原密度和TCR親和力。在微環(huán)境中腫瘤的主要免疫抑制機(jī)制是抗原識(shí)別失敗，原因是低親和力的TCR和癌癥相關(guān)的肽-MHC復(fù)合物的相互作用。
TCR對(duì)自身衍生肽（如腫瘤抗原）的親和力低于TCR對(duì)病原體衍生抗原的親和力。因此，通常更難以分離對(duì)TAA具有足夠敏感性的T細(xì)胞，這是過(guò)繼性細(xì)胞療法（ACT）的個(gè)障礙。
另一方面，TCR的高親和力伴隨著自身免疫應(yīng)答，當(dāng)患者接受ACT治療時(shí)，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良事件。已經(jīng)報(bào)道，ACT利用超生理的、高親和力的TCR不能提高療效，反而MHC-肽復(fù)合物的數(shù)量少能夠?qū)崿F(xiàn)高TCR占用，原因是單個(gè)復(fù)合體可以串聯(lián)接合并觸發(fā)數(shù)百個(gè)TCR。
總之，這表明一種模型，其中TCR的理想親和力應(yīng)提供足夠長(zhǎng)時(shí)間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)近端信號(hào)的傳導(dǎo)，但也應(yīng)適當(dāng)?shù)亟档陀H和力，以分離并允許盡可能多的TCR遇到MHC-肽復(fù)合物。
scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞功能反應(yīng)的影響仍未*了解。通常，與天然TCR親和力相比，用scFv構(gòu)建的CAR具有更高的親和力。由于大多數(shù)TAA在腫瘤上高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)，增加CAR的親和力將可能導(dǎo)致on-target/off-tumor效應(yīng)引起的嚴(yán)重不利影響的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須考慮刺激閾值以獲得CAR-T細(xì)胞活化的*特異性。
與天然T細(xì)胞類(lèi)似，CAR-T細(xì)胞也可以以連續(xù)方式殺死多個(gè)靶細(xì)胞。當(dāng)通過(guò)CAR刺激而不是通過(guò)TCR刺激腫瘤細(xì)胞時(shí)，可以更快地消除腫瘤細(xì)胞，因?yàn)镃AR可以比TCR更快地從垂死的腫瘤細(xì)胞中解離出來(lái)。因此，增加CAR-T細(xì)胞的親和力可能減少/防止連續(xù)殺傷，促進(jìn)T細(xì)胞衰竭，并減少中樞記憶和效應(yīng)表型T細(xì)胞的產(chǎn)生和持久性，或通過(guò)激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來(lái)增加T細(xì)胞的損失等一系列不利影響。
實(shí)體瘤靶抗原的篩選
ACT的關(guān)鍵是選擇靶抗原，以提供足夠的功效并使毒性小化。一些針對(duì)腫瘤特異性抗原的CAR已在臨床前開(kāi)發(fā)當(dāng)中，包括針對(duì)異常糖基化癌基因的CAR，如MUC1的Tn糖型，以及腫瘤特異性活化形式的整合素，以及臨床上，如CARs靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄變體EGFRvIII。
在沒(méi)有更多腫瘤特異性靶標(biāo)的情況下，CAR-T細(xì)胞療法很可能選擇繼續(xù)靶向在正常組織中也表達(dá)的實(shí)體瘤TAA。實(shí)際上，大多數(shù)正在進(jìn)行的針對(duì)實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)都針對(duì)這樣的TAA。
了解正常組織是否表達(dá)抗原及其表達(dá)水平以預(yù)測(cè)潛在毒性至關(guān)重要。
基于基因表達(dá)（RNA測(cè)序或微陣列）或免疫組織化學(xué)（IHC），可獲得正常組織上抗原表達(dá)的幾個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)。但是，這些技術(shù)包含限制和陷阱。對(duì)于基因表達(dá)分析，非常罕見(jiàn)但關(guān)鍵細(xì)胞表達(dá)的抗原可能被低估。此外，可能無(wú)法區(qū)分表達(dá)的基因是來(lái)自組織還是來(lái)自浸潤(rùn)細(xì)胞。此外，假陽(yáng)性和假陰性是尚未解決的問(wèn)題，IHC對(duì)低表達(dá)抗原的敏感性可能不足以選擇實(shí)體瘤的CAR靶標(biāo)。
新技術(shù)，如單細(xì)胞RNA測(cè)序，可以提供更準(zhǔn)確的表達(dá)譜，使研究人員能夠更好地預(yù)測(cè)新型CAR-T細(xì)胞的功效和毒性。
擴(kuò)大CAR-T細(xì)胞療法治療窗的策略
“治療窗”是藥物毒理學(xué)的術(shù)語(yǔ)，定義為功效和毒性之間的一系列劑量，實(shí)現(xiàn)高治療益處并且不會(huì)導(dǎo)致不可接受的毒性。盡管工程化細(xì)胞與傳統(tǒng)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)大不相同，但將治療窗的概念應(yīng)用于ACT領(lǐng)域?qū)τ趦?yōu)化治療方法將是有價(jià)值的。
圖解說(shuō)明CAR-T細(xì)胞療法的治療窗
圖A：小有效劑量（MED）和大耐受劑量（MTD）之間的范圍；
圖B：在CAR-T細(xì)胞療法中，僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的靶向抗原或僅在非關(guān)鍵組織上表達(dá)的抗原擴(kuò)大了治療窗，因?yàn)椴粫?huì)對(duì)重要組織產(chǎn)生直接毒性；
圖C：靶向在關(guān)鍵正常組織/細(xì)胞中表達(dá)的抗原通過(guò)降低MTD使治療窗變窄。
不能僅基于抗原表達(dá)譜來(lái)解決治療窗的確定。例如，即使在腫瘤和正常組織的抗原表達(dá)差異很大的情況下，其中抗原在腫瘤中以較高密度表達(dá)，但由于內(nèi)在的免疫抑制，腫瘤可能仍然比正常組織對(duì)CAR-T細(xì)胞更具抗性。正常組織中不存在的TME。在這種情況下，腫瘤抑制T細(xì)胞浸潤(rùn)或誘導(dǎo)T細(xì)胞功能減退將通過(guò)增加MED來(lái)縮小CAR-T細(xì)胞的治療窗。
鑒于真正的腫瘤特異性靶表面抗原尚未被發(fā)現(xiàn)，TAA可能是我們?cè)诳深A(yù)見(jiàn)的未來(lái)的合理目標(biāo)，因此，對(duì)于實(shí)體瘤的治療，制定擴(kuò)大CAR-T細(xì)胞療法治療窗的策略是必須的。
擴(kuò)大治療窗的可能方法包括：（1）優(yōu)化CAR密度、親和力和感應(yīng)；（2）優(yōu)化免疫突觸形成；（3）聯(lián)合治療；（4）CAR-T細(xì)胞和治療劑的局部遞送；（5）誘導(dǎo)靶抗原表達(dá)；（6）其他修飾。
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優(yōu)化CAR密度、親和力和感應(yīng)
盡管增加CAR親和力使得能夠識(shí)別與靶密度無(wú)關(guān)的抗原，但該作用可能引起嚴(yán)重的副作用，即on-target/off-tumor毒性，并降低連續(xù)殺傷靶腫瘤的能力。
因此，重要的是要制定合理的策略，以確定理想的CAR親和力。
使用輕鏈交換技術(shù)構(gòu)建親和調(diào)節(jié)的scFv是測(cè)量CAR的*親和力的可行方法之一。報(bào)道表明，CAR-T細(xì)胞的親和力高于確定閾值不一定是必需的，或者更重要的是，通過(guò)產(chǎn)生對(duì)同一表位具有不同親和力的CAR，并鑒定這些表位特異性CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出大的細(xì)胞裂解、增殖和安全潛力的低親和力。
除了改變scFv親和力外，調(diào)節(jié)表面CAR表達(dá)水平是誘導(dǎo)理想CAR信號(hào)傳導(dǎo)的重要因素。CAR-T細(xì)胞功能受CAR密度和靶抗原密度控制，其中任一個(gè)的低表達(dá)都可導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞的功能和靈敏度有限。
另一方面，CAR結(jié)構(gòu)和高CAR密度可能導(dǎo)致產(chǎn)生CAR的連續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)（強(qiáng)直信號(hào)），然后通過(guò)增加T細(xì)胞分化、耗竭和活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）而誘導(dǎo)較差的抗腫瘤作用和T細(xì)胞的體內(nèi)植入。因此，改善CAR密度同時(shí)保持表達(dá)低于強(qiáng)直信號(hào)誘導(dǎo)所需的閾值，可以誘導(dǎo)足夠的抗腫瘤功效并保持對(duì)每種靶抗原和CAR構(gòu)建體的安全潛力。
此外，可以通過(guò)腫瘤細(xì)胞上的兩種不同抗原識(shí)別組合抗原。（1）“AND”邏輯門(mén)控CAR：僅在同時(shí)識(shí)別兩種單獨(dú)的所需抗原時(shí)才能*地激活CAR-T細(xì)胞。（2）“OR”邏輯門(mén)控CAR：CAR-T細(xì)胞通過(guò)表達(dá)兩個(gè)CAR或具有串聯(lián)抗原結(jié)合域的單個(gè)CAR，識(shí)別兩種不同抗原中的任一種來(lái)驅(qū)動(dòng)*信號(hào)傳導(dǎo)。其中，“AND”邏輯CAR的工程T細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)更具特異性和更安全的靶向，“OR”邏輯CAR有潛力克服由于靶抗原丟失而導(dǎo)致的低靶抗原表達(dá)和腫瘤逃逸。
另一個(gè)有吸引力的平臺(tái)是使用銜接分子開(kāi)發(fā)“通用”CAR，以克服抗原表達(dá)中的腫瘤異質(zhì)性并使CAR-T細(xì)胞的活化更具條件性。該平臺(tái)轉(zhuǎn)化為臨床的一個(gè)潛在問(wèn)題是銜接分子的免疫原性。
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優(yōu)化免疫突觸形成
如上所述，與組織性良好的TCR IS的靶眼結(jié)構(gòu)相比，CAR IS更加雜亂，并且其特征在于Lck排列的多焦點(diǎn)模式、肌動(dòng)蛋白環(huán)減少和LFA-1擴(kuò)散分布。與TCR IS相比，CAR IS的顯著能力實(shí)際上是即時(shí)誘導(dǎo)近端信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞毒性顆粒的快速遞送，其由MTOC向CAR IS的更快遷移介導(dǎo)。這些優(yōu)勢(shì)使CAR-T細(xì)胞能夠快速?gòu)钠茐牡?/span>腫瘤細(xì)胞中解離，并介導(dǎo)有效的連續(xù)殺傷。
近，一些研究報(bào)告了關(guān)于CAR設(shè)計(jì)如何影響IS形成的重要發(fā)現(xiàn)。有研究使用由CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的CD19特異性CAR檢測(cè)CAR IS質(zhì)量，并確定CD28加4-1BB的第三代CAR優(yōu)于基于CD28的第二代CAR，包括IS的結(jié)構(gòu)、信號(hào)和功能。與雙特異性CAR-T細(xì)胞相比，對(duì)兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原HER2和IL13Rα2特異的CAR表現(xiàn)出顯著更高的F-肌動(dòng)蛋白積累和MTOC極化得增加。
CAR IS的結(jié)構(gòu)特征現(xiàn)在正在闡明當(dāng)中，其調(diào)節(jié)將是CAR-T細(xì)胞治療的一個(gè)很好的選擇。已經(jīng)有幾種通過(guò)免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDS）改善CAR IS的嘗試，例如來(lái)那度胺-沙利度胺的合成衍生物。來(lái)那度胺通過(guò)增加肌動(dòng)蛋白的積累提高了CAR功效，是一種有潛力增強(qiáng)CAR活性的聯(lián)合療法。
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聯(lián)合療法
聯(lián)合療法是一種通過(guò)克服腫瘤異質(zhì)性和擴(kuò)大治療窗來(lái)推動(dòng)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的有希望的策略。
溶瘤病毒（OVs）是用于治療實(shí)體瘤的有希望的藥劑。OV特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞不起作用，促使直接的腫瘤溶解，并激活免疫系統(tǒng)。此外，還可對(duì)OV進(jìn)行基因修飾，使其在TME中選擇性地表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因。OV在局部表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因的同時(shí)恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力提供了與CAR-T細(xì)胞療法組合的合理理由。
其他組合方法包括與對(duì)4-1BB共刺激受體特異的激動(dòng)性抗體組合，其可以直接激活CAR-T細(xì)胞并且還可以減少宿主免疫抑制性免疫細(xì)胞，例如Tregs或MDSC。
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CAR-T細(xì)胞和治療劑的局部遞送
CAR-T細(xì)胞的全身性遞送可能會(huì)受到對(duì)實(shí)體瘤的可及性的限制，還涉及安全性問(wèn)題。因此，直接施用（局部給藥）到腫瘤部位中是CAR-T細(xì)胞遞送的一種解決方法。另一種方法是設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞僅在腫瘤部位或主要在腫瘤部位起作用。
為了克服免疫TME，細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-18、IL-12的局部遞送，CCL19和IL-7的結(jié)合或表達(dá)檢查點(diǎn)阻斷劑的CAR-T細(xì)胞，可以幫助克服TME對(duì)T細(xì)胞浸潤(rùn)和功能的阻礙。臨床前模型中已經(jīng)證明了這些方法具有增強(qiáng)的治療功效，同時(shí)能避免全身不良事件。
>>>>靶抗原表達(dá)的誘導(dǎo)
正如之前說(shuō)的，靶抗原密度可以控制CAR-T細(xì)胞療法的功效。
此外，靶抗原的丟失或下調(diào)是腫瘤逃逸的主要原因。靶細(xì)胞上抗原表達(dá)的誘導(dǎo)或再誘導(dǎo)可能是擴(kuò)大治療窗的有吸引力的方法。
據(jù)報(bào)道，亞致死劑量的輻射可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上TAA（如間皮素和CEA）的表達(dá)。此外，表觀遺傳控制也可以調(diào)節(jié)靶抗原表達(dá)，例如，抗甲基化藥物氮雜胞苷（5-AZA）可以在治療后重新誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞上的CD20表達(dá)，包括用靶向CD20的利妥昔單抗治療后。
>>>>其他修飾
CAR-T細(xì)胞裝備zi殺系統(tǒng)，例如誘導(dǎo)型caspase-9 （iCas9）或共表達(dá)截短的EGFR，將加強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的安全性。這些系統(tǒng)可以通過(guò)施用相關(guān)藥劑引發(fā)細(xì)胞固有細(xì)胞凋亡或細(xì)胞外源性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞耗竭，從而誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的消耗。
可誘導(dǎo)的CAR系統(tǒng)，包括TET誘導(dǎo)系統(tǒng)，它能夠使用藥物誘導(dǎo)控制CAR表達(dá)。
合成的Notch系統(tǒng)（synNotch）為CAR-T細(xì)胞的多樣化和靈活性提供了另一個(gè)有吸引力的平臺(tái)。SynNotch受體可以允許在抗原識(shí)別時(shí)向T細(xì)胞添加定制應(yīng)答程序。 例如，synNotch可以在識(shí)別抗原時(shí)驅(qū)動(dòng)定制的細(xì)胞因子分泌，偏向性的T細(xì)胞分化，或局部遞送治療有效載荷，如抗體。
結(jié)語(yǔ)
CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤是復(fù)雜且多因素的，具有比用于治療B細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的CD19靶向更窄的治療窗。
盡管臨床研究越來(lái)越多，但除了腦室內(nèi)遞送IL13Rα2CAR的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤外，很少有明顯的療效。在這種情況下，建立擴(kuò)大治療窗的策略顯得至關(guān)重要。
腫瘤生物學(xué)、TME和CAR-T細(xì)胞生物學(xué)仍有許多未知數(shù)。幸運(yùn)的是，解決這些問(wèn)題的強(qiáng)大工具，如生物信息學(xué)、質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)、大規(guī)模細(xì)胞計(jì)數(shù)和單細(xì)胞RNA測(cè)序等新興技術(shù)，將使我們能夠獲得有關(guān)腫瘤、TME組分和免疫細(xì)胞的信息。
此外，基因編輯技術(shù)的成熟，例如CRISPR / Cas9系統(tǒng)，或合成生物學(xué)，例如synNotch系統(tǒng)，將能夠幫助靈活地設(shè)計(jì)T細(xì)胞，有利于CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的突破。
當(dāng)向患者施用新的CAR-T細(xì)胞療法時(shí)，已經(jīng)報(bào)道了幾個(gè)具有意外嚴(yán)重毒性的病例。不幸的是，目前的技術(shù)不允許我們預(yù)測(cè)臨床環(huán)境中的所有毒性。因此，目前只有臨床試驗(yàn)可以揭示ACT的安全性和有效性信息。未來(lái)，持續(xù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn)可以預(yù)測(cè)毒性的臨床前模型，以及合理規(guī)劃和實(shí)施臨床試驗(yàn)，對(duì)于CAR-T細(xì)胞療法的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要。
參考出處：
frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.02486/ful
science.sciencemag.org/content/359/6382/1361/tab-figures-data
13224517959
